免疫堿性磷酸酶組織化學(xué)技術(shù)
2010/1/31
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免疫堿性磷酸酶組織化學(xué)技術(shù)
免疫堿性磷酸酶組織化學(xué)技術(shù)是以堿性磷酸酶(AKP或AP)取代HRP來(lái)顯示結(jié)果的免疫酶組織化學(xué)技術(shù)。zui早出現(xiàn)的是間接免疫堿性磷酸酶法(1AP),1983年Mason及Moir等建立了堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶(APAAP)復(fù)合物法。隨后,人們建立了更為敏感的生物素—親和素—堿性磷酸酶復(fù)合物(ABC-AP)法、S-P堿性磷酸酶法、EnVision堿性磷酸酶法以及用于原位雜交檢測(cè)的抗地高辛(Dig)、抗生物素(biotin)和抗熒光素(FITC)—AKP檢測(cè)系統(tǒng)。因免疫堿性磷酸酶技術(shù)具有*優(yōu)點(diǎn),如敏感的酶底物顯色系統(tǒng)、染色背景低,故應(yīng)用日益廣泛,尤其在原位雜交、TUNEL等的檢測(cè)。
一、間接免疫堿性磷酸酶法
此方法的基本原理與HRP-抗體間接法類似,體,將其制備成酶標(biāo)記抗體。其染色步驟如下。
(1)切片脫蠟至水,PBS洗3min×3次。所不同的是用AKP代替HRP標(biāo)記第
(2)蛋白酶消化或AR(組織抗原的暴露或抗原的修復(fù),此步視情況而定)。
(3)滴加正常血清,阻斷20min(減少非特異性背景染色),吸去多余血清。
(4)滴加適當(dāng)稀釋的特異性一抗,37℃孵育30~60min或4℃過(guò)夜,PBS洗3min×3次。
(5)適當(dāng)稀釋的AKP標(biāo)記的二抗37℃孵育30~60min,PBS洗3min×3次。
(6)加入0.02mol/L(pH9.0)TBS(內(nèi)含lmmol/L左旋咪唑,5mmol/L MgClz)阻
斷內(nèi)源性堿性磷酸酶。
(7)切片上滴加50—100~1底物溶液(BCIP/NBT),室溫中濕盒內(nèi)避光顯色30min一48h,顯色30min后鏡下觀察,待陽(yáng)性充分顯示后水洗終止反應(yīng)。
(8)充分水洗后用核固紅復(fù)染5min,沖洗后系列乙醇脫水,二甲苯透明,樹膠封片。
(9)結(jié)果觀察,背景呈紅色,陽(yáng)性產(chǎn)物呈紫藍(lán)色。
注:染色結(jié)果可根據(jù)不同的顯色底物而顯示不同顏色,如用堅(jiān)固紅(FR/AS-MX)產(chǎn)生的底物為玫瑰紅色,用堅(jiān)固藍(lán)(FB/AS-MX)則產(chǎn)物為紫綠色,而BCIP/NBT為紫藍(lán)色。特別要強(qiáng)調(diào)的是,F(xiàn)R/AS-MX和FB/AS-MX底物系統(tǒng)產(chǎn)生的顏色反應(yīng)產(chǎn)物,能溶于有劑溶,如乙醇、二甲苯,所以不能用樹膠封片。
二、APAAP法
APAAP法的原理與PAP法類似(見圖4—12),都屬于未標(biāo)記抗體橋聯(lián)法,所不同的是用AKP取代了HRP。該方法較IAP法敏感性高,特別是用于標(biāo)記固定過(guò)的組織,其染色步驟如下。
(1)~(4)步同IAP法。
(5)適當(dāng)稀釋橋抗體(二抗),37~C溫育30min或室溫中孵育60min。
(6)PBS洗3minX 3次。
(7)適當(dāng)稀釋APAAP復(fù)合物(與特異性一抗同屬),37℃溫育30min或室溫中孵育60min。
(8)PBS洗3minx 3次。
(9)底物顯色及復(fù)染、封片同IAP法。
注:特異性一抗和APAAP復(fù)合物中IgG必須來(lái)源于同一種屬動(dòng)物,*抗體的稀釋度要較IAP法高(濃度低)。
APAAP法的主要優(yōu)點(diǎn)是非特異性背景染色較淺,因?yàn)槠洳皇軆?nèi)源性過(guò)氧化物酶的干擾,PAAP復(fù)合物所用的AKP是從小牛腸組織中提取,只存在于腸組織。同時(shí),反應(yīng)底物溶液的左旋咪唑具有抑制非腸源性堿性磷酸酶活性的作用,且不影響APAAP復(fù)合物中腸源性KP的活性。因此,在檢測(cè)那些富含內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的組織、冰凍切片及造血組織標(biāo)本時(shí),PAAP法是一種很好的方法。