關(guān)于ELISA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制要點(diǎn)簡(jiǎn)述
許多試劑檢測(cè)都涉及到標(biāo)準(zhǔn)曲線的問(wèn)題,ELISA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線做的好與壞會(huì)直接影響到實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,甚至是關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗,那么究竟如何繪制或制作標(biāo)準(zhǔn)曲線呢?
一、做標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品檢測(cè)時(shí)有幾個(gè)問(wèn)題需要注意
1、樣品的濃度等指標(biāo)是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出來(lái)的,所以首先要把做標(biāo)準(zhǔn)曲線看作是比做正式實(shí)驗(yàn)還要重要的一件事,否則后面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)從談起。
2、設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的標(biāo)準(zhǔn)濃度范圍要有一個(gè)比較大的跨度,并且要能涵蓋你所要檢測(cè)實(shí)驗(yàn)樣品的濃度,即樣品的濃度要在標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍之內(nèi),人ELISA試劑盒包括上限和下限。而對(duì)于呈S型的標(biāo)準(zhǔn)曲線,盡量要使實(shí)驗(yàn)樣品的濃度在中間坡度zui陡段,即曲線幾乎成直線的范圍內(nèi)。
3、ELISA試劑盒采用倍比稀釋法配制標(biāo)準(zhǔn)曲線中的標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度,這樣就能夠保證標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度不會(huì)出現(xiàn)較大的偏離。
4、檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品時(shí),應(yīng)按濃度遞增順序進(jìn)行,以減少高濃度對(duì)低濃度的影響,提高準(zhǔn)確性。
5、標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品數(shù)一般為7個(gè)點(diǎn),但至少要保證有5個(gè)點(diǎn)。
6、做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)因?qū)嶒?yàn)要求不同而有所變動(dòng),但一般來(lái)說(shuō),相關(guān)系數(shù)R至少要大于0.98,對(duì)于有些實(shí)驗(yàn),至少要0.99甚至是0.999.
二、選擇什么方程去擬合
在S曲線的低濃度部門(mén)可以用乘冪方程很好的擬合,中低濃度部門(mén)可以用直線方程,中間部門(mén)可用對(duì)數(shù)方程,而中后段可用四參數(shù)。免疫檢測(cè)時(shí)尺度點(diǎn)(可以是倍比稀釋的,也可以不是)濃度假如和相應(yīng)的吸光度(OD)值假如能夠呈現(xiàn)直線關(guān)系當(dāng)然是的了,這時(shí)可以通過(guò)EXELL等利便的獲得擬合曲線,進(jìn)而推算出樣品的濃度值。
關(guān)于尺度曲線的擬合方式,直線、二次曲線、三次曲線、指數(shù)、對(duì)數(shù)等雖都可用于ELISA及其它生物學(xué)反應(yīng)中的曲線擬合,但都只合用于曲線的一部門(mén),有的合用于前半段,有的合用于后半段,有的合用于中間一段,而Logistic曲線則對(duì)曲線的全部都有較好的合用性。在一個(gè)長(zhǎng)的區(qū)間內(nèi),Logistic應(yīng)該都能擬合得較為理想。假如用來(lái)定量,S形曲線的中間段(較陡處)是比較好的,而兩真?zhèn)€平坦部門(mén)計(jì)算誤差會(huì)大,有時(shí)甚至?xí)艽?。用于免疫檢測(cè)的所謂“尺度曲線”實(shí)在稱(chēng)為擬合曲線比較合適。目前上zui流行的免疫檢測(cè)擬合方式是“四參數(shù)邏輯擬合”,用這種擬合方式往往能夠比較的反映濃度和吸光度的曲線關(guān)系,從而進(jìn)一步比較準(zhǔn)確的獲得樣品中待測(cè)物質(zhì)的濃度值。但我們做免疫檢測(cè)很少有時(shí)候能夠有這么理想的情況,標(biāo)品濃度和相應(yīng)OD值往往是"S"型的曲線關(guān)系,這時(shí)就不能用直線擬合的方式了,而對(duì)擬合方法進(jìn)行選擇就是必要的了。樞紐在于你的尺度曲線做到了S形的哪一部門(mén),你想檢測(cè)的樣品濃度在曲線的哪一部門(mén)。當(dāng)然,假如用于定量,仍是在中間一段較好。但建模型是一回事,而用它來(lái)定量是另一回事。ELISA試劑盒這些方法固然沒(méi)有一種方法可以通用,但也都可以用。但并不是說(shuō)它就是的。事實(shí)上不僅是ELISA,其它良多生物學(xué)反應(yīng)都是S形曲線,也都可以用Logistic曲線擬合。