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ELISA中的試劑-酶的底物

2010-03-24 [1862]

ELISA中的試劑-酶的底物 
 
酶的底物
3.3.1  HRP的底物
HRP催化過氧化物的氧化反應(yīng),代表性的過氧化物為H2O2,其反應(yīng)式如下:
DH2+ H2O2 D+ H2O
上式中,DH2為供氧體,H2O2為受氫體。在ELISA中,DH2一般為無色化合物,經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物,以便作比色測定。常用的供氫體有鄰苯二胺(O-phenylenediamine, OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(3,3\\',5,5\\'-tetramethylbenzidine, TMB)和ABTS[2,2\\'-azino-di-(3- ethylbenziazobine sulfonate-6)]。
OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色,用酸終止酶反應(yīng)后,在492nm處有zui高吸收峰,靈敏度高,比色方便,是HRP結(jié)合物zui常用的底物。OPD本身難溶于水,OPD•2HCL為水溶性。曾有報(bào)道OPD有致異變性,操作時(shí)應(yīng)予注意。OPD見光易變質(zhì),與過氧化氫混合成底物應(yīng)用液后更不穩(wěn)定,須現(xiàn)配置現(xiàn)用。在盒中,OPD和H2O2一般分成二組分,OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式,片劑中含有發(fā)泡助溶劑,使用更為方便。過氧化氫則配入底物緩沖液中,有制成易保存的濃縮液,使用時(shí)用蒸餾水稀釋。先進(jìn)的ELISA盒中則直接配成含保護(hù)劑的工作濃度為0.02% H2O2的應(yīng)用液,只需加入OPD后即可作為底物應(yīng)用液。
TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色,目視對比鮮明。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定,可配成溶液,只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液,可直接作底物使用。另外,TMB又有無致癌性等優(yōu)點(diǎn),因此在ELISA中應(yīng)用日趨廣泛。酶反應(yīng)用HCL或H2SO4終止后,TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈,可在比色計(jì)中定量,zui適吸收波長為405nm。
ABTS雖不如OPD和TMB敏感,但空白值極低,也為一些盒所采用。
另一種HRP的底物為3-(4-羥基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA],經(jīng)HRP作用后,產(chǎn)物顯熒光,可用熒光光度計(jì)測量。用于ELISA的優(yōu)點(diǎn)為可加寬定量測定的線性范圍。
HRP對氫受體的專一性很高,僅作用于H2O2、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(urea peroxide)。H2O2應(yīng)用zui多,但尿素過氧化物為固體,作為較H2O2方便、穩(wěn)定。盒供應(yīng)尿素過氧化物片劑,用蒸餾水溶解后,在底物緩沖液中密閉、低溫(2~8℃)可穩(wěn)定1年。
3.3.2 AP的底物
AP為磷酸酯酶,一般采用對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作為底物,可制成片劑,使用方便。產(chǎn)物為的對硝基酚,在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后,可穩(wěn)定一時(shí)間。
AP也有發(fā)熒光底物(磷酸4-甲基傘酮),可用于ELISA作熒光測定,敏感度較高于用顯色底物的比色法。
3.4  洗滌液
在板式ELISA中,常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水。
3.5  酶反應(yīng)終止液
常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸,其濃度按加量及比色液的zui終體積而異,在板式ELISA中一般采用2mol/L。
3.6 陽性對照品和陰性對照品
陽性對照品(positive control)和陰性對照品(negative control)是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品,同時(shí)也作為判斷結(jié)果的對照,因此對照品,特別是陽性對照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測標(biāo)本的組成相一致。以人血清為標(biāo)本的測定,對照品也為人血清,因?yàn)檎H搜逶诟鞣NELISA模式中可產(chǎn)生不同程度的本底。由于大量正常人血甭較難得到,國外盒中的對照品多以復(fù)鈣人血漿(recalcified human plasma)為原料,即在血漿中加入鈣離子,使其中的纖維蛋白質(zhì)凝固,除去凝塊后所得的液體,其組成與血清相似。陰性對照品須先行檢測,確定其中不含待測物質(zhì)。例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg,抗HBs也是陰性。陽性對照品多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì),其中加入一定量的待檢物質(zhì),此量在說明書中標(biāo)明。加入的量應(yīng)與的敏感度相稱,在測定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較,可對標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量有一個(gè)粗略的估計(jì)。國外檢測HBsAg的ELISA盒檢測敏感度約為0.5ng/ml,陽性對照品中含量約為10ng/ml。在對照品中一般加入抗生素和防腐劑,以利保存。