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臨床ELISA測定的常用模式--雙抗體夾心法測抗原

2010-01-25 [2431]

臨床ELISA測定的常用模式--雙抗體夾心法測抗原
 
    對于含多個抗原決定簇的大分子蛋白,使用雙抗體夾心ELISA模式測定相當(dāng)簡便,現(xiàn)有的商品試劑盒基本上都采用此種測定模式。具體測定方法如下:
    1.首先以雙抗體之一于碳酸鹽緩沖液中4℃下過夜包被聚苯乙烯等固相,形成固相抗體,洗滌去除未與固相結(jié)合或結(jié)合不緊的抗體后,用小牛血清或牛血清白蛋白等封閉,洗滌去除未結(jié)合的部分及雜質(zhì)。
    2.加入含待測物的臨床樣本如血清等,溫育一定時間后洗板;此時,待測抗原就會與固相上特異抗體反應(yīng)而吸附于固相上。
    3.加入酶標(biāo)記的雙抗體之二,溫育一定時間后洗板;此時,在固相上即形成雙抗體與特異抗原的夾心產(chǎn)物。
    4.加入酶底物,溫育顯色測定(圖2—1)。
 
    在該測定模式中,有兩步溫育和板孔洗滌步驟,如果將上述測定步驟2和3并為一步,即將待測樣本和酶標(biāo)抗體同時加入,從而僅有一步溫育和洗板過程,即為通常所說的“一步法”。zui初的雙抗夾心ELISA試劑盒,均采用兩步法。后來,人們?yōu)榱斯?jié)省時間,簡化操作步驟,試劑生產(chǎn)廠家逐步推出了“一步法”試劑盒。目前在我們的臨床實(shí)驗(yàn)室中,測定大分子抗原如HBsAg、。FP和hCG等,基本上都采用一步法。一步法相比于兩步法,雖然操作簡單‘但有其固有的缺陷,處理不好,對ELISA測定結(jié)果有嚴(yán)重影響。
    在通常的兩步溫育洗滌方法中,抗原抗體反應(yīng)將遵循下述規(guī)律,即在*步中加入的待測標(biāo)本中抗原(Ag)濃度逐步增加時,將使固相抗體(Ab)與抗原的結(jié)合逐步達(dá)到飽和[(1)式],這樣當(dāng)隨后加入一定濃度的酶標(biāo)抗體(Ab’)后,a復(fù)合物的形成將直接與在*步中形成的b復(fù)合物相關(guān)[(2)式],因此,待測抗原濃度的逐步增加導(dǎo)致了顯色的逐步加深,當(dāng)抗原濃度增加到一定程度時,反應(yīng)顯色達(dá)到平臺,而呈S形變化曲線(圖2—2)。
    而一步法雙抗夾心ELISA的反應(yīng)曲線則為鐘形曲線(圖2—3)。也就是說測定顯色隨著待則標(biāo)本中抗原濃度的增加而升高至一定程度后,測定吸光度即隨抗原濃度的增加而開始下降直至不顯色,即所謂的“鉤狀效應(yīng)”(hook eHect),也就是我們在免疫沉淀試驗(yàn)中所稱的“帶現(xiàn)象”(zonephen。menon)。一步法的反應(yīng)平衡式如(3)式
    此外,b和c復(fù)合物的增加亦使得“雙抗體夾心復(fù)合物”難以形成。但如果  固相單抗和標(biāo)記單抗采用針對抗原的不同且空間距離較遠(yuǎn)的決定簇的抗體,即包被使用一種  單抗,酶標(biāo)記使用另一種單抗,同時充分混勻反應(yīng)液,并適當(dāng)延長反應(yīng)溫育時間,則可使b,。和  d復(fù)合物減少至zui低程度,而大大減輕“鉤狀效應(yīng)”。
    我們曾使用本室能得到的含zui高濃度(約2mg/m1)HBsAg的血清樣本對目前國內(nèi)較大的試劑生產(chǎn)廠家的“一步法”HBsAg測定ELISA試劑盒的“鉤狀效應(yīng)”進(jìn)行了評價,盡管大部分有在HBsAgzui高濃度下的測定顯色較次高濃度(1:lo稀釋)顯色要淺的現(xiàn)象,但均未出現(xiàn)該份樣本測定為陰性的情況。盡管如此,在臨床實(shí)際工作中,仍有可能遇到“鉤狀效應(yīng)”較嚴(yán)重的HBsAg測定ELISA試劑盒,我們也經(jīng)常聽到基層實(shí)驗(yàn)室同行在這方面的反映。因此,大家還應(yīng)該重視這方面的問題·,當(dāng)發(fā)現(xiàn)測定結(jié)果明顯與臨床不符或與相關(guān)測定指標(biāo)互有矛盾,如 HBeAg陽性樣本HBsAg測定為陰性時,就應(yīng)考慮HBsAg測定可能存在的“鉤狀效應(yīng)”問題。
    綜上所述,一步法ELISA試劑盒作為迎合臨床實(shí)驗(yàn)室簡便快速要求的產(chǎn)物,有著巨大的市場,其雖有潛在缺陷,易導(dǎo)致含高濃度待測物的標(biāo)本檢測為陰性(假陰性),但精心的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),對包被和酶標(biāo)記抗體仔細(xì)選擇,*可以將“鉤狀效應(yīng)”出現(xiàn)的可能性降至zui低。此外,建議生產(chǎn)HBsAg,aFP和hCGELISA"一步法”測定試劑盒的廠家,應(yīng)對所產(chǎn)的試劑在出廠前對其“鉤狀效應(yīng)"(hookeffect)進(jìn)行充分的研究,并提醒用戶在使用時應(yīng)注意之處。
    雙抗體夾心法測抗原另一個所需要注意的是類風(fēng)濕因子(RF)的干擾。我們知道,RF是一種抗變性IgG的自身抗體,主要為19S的IgM類抗體,也可見7S的IgG及IgA類抗體。這種自身抗體的特性是其是能與多種動物的變性IgG的Fc部分結(jié)合。因此,如果血清標(biāo)本中含有RF,在雙抗夾心ELISA檢測時,其即可作為固相抗體和酶標(biāo)抗體(均為IgG)之間的橋接抗原,而產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。因此,如果使用抗體的Fab2:或Fab片段作為酶標(biāo)記用抗體,則可避免RF的干擾。、