哺乳動(dòng)物細(xì)胞的RNAi技術(shù)策略
目前RNAi技術(shù)已經(jīng)進(jìn)入了生物科學(xué)研究的許多領(lǐng)域，成為了一種主要的生物學(xué)研究工具，發(fā)展得相當(dāng)迅速，并受到了此次諾貝爾獎(jiǎng)評(píng)審委員會(huì)的青睞，獲得2006年諾貝爾獎(jiǎng)醫(yī)學(xué)/生理獎(jiǎng)。然而這一才歷經(jīng)十個(gè)年頭的技術(shù)依然對(duì)于許多研究人員來(lái)說(shuō)還是很陌生的，以下是有關(guān)RNAi技術(shù)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中應(yīng)用的具體設(shè)計(jì)策略，主要來(lái)自于《遺傳》雜志2005年“RNA干涉（RNAi）技術(shù)應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的研究策略”，希望能給從事或者準(zhǔn)備從事RNAi相關(guān)實(shí)驗(yàn)的研究人員以幫助。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞的RNAi技術(shù)策略
一、靶siRNA序列選擇
靶siRNAA序列選擇是RNAi實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。哺乳動(dòng)物細(xì)胞RNAi實(shí)驗(yàn)中，使用zui廣泛且zui有效的是21bp siRNA。siRNA由正義鏈和反義鏈組成，兩條鏈3’端均有2個(gè)堿基突出，一般為UU或dTdT，其中正義鏈的前19nt與靶基因序列相同。
1. siRNA設(shè)計(jì)的原則
SiRNA雙鏈設(shè)計(jì)時(shí)，一般在靶mRNA起始密碼下游100—200bp至翻譯終止密碼上游d0—100bp的范圍內(nèi)搜尋AA序列，并記錄每個(gè)AA3’端相鄰19個(gè)核苷酸作為候選si.RNA靶位點(diǎn)。其中AA（N19）TT是的序列，若靶mRNA中無(wú)此序列，亦可選用NA（N21）或NAR（N17）YNN（R表示嘌呤，Y表示嘧啶），但在合成時(shí)，siRNA的正義鏈3’端需用dT—dT代替。TuscRl等建議設(shè)計(jì)的siRNA不要針對(duì)mRNA的5’和3’端非編碼區(qū)，因?yàn)檫@些區(qū)域有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn)，而UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會(huì)影響siRNP（siRNA protein complex，核酸內(nèi)切酶復(fù)合物）結(jié)合mRNA，從而影響siRNA干擾的效果。zui后還應(yīng)將候選siRNA序列在GenBank進(jìn)行BLAST檢索，與非同源基因具有3個(gè)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞的RNAi技術(shù)策略
3個(gè)以上堿基相異的序列方可選用。
2. siRNA的序列結(jié)構(gòu)特征
除了靶序列位點(diǎn)的選擇，siIRNA序列本身結(jié)構(gòu)特征亦會(huì)影響到RNAi效率。RNAi實(shí)質(zhì)上可視為一個(gè)RNA與蛋白質(zhì)互作過(guò)程，包括siRNA與RISC結(jié)合、RISC的激活以及RISC與靶mRNA的結(jié)合和切割，這種互作效應(yīng)的存在，往往造成siRNA鏈的選擇具有偏愛(ài)性。Reynolds等通過(guò)對(duì)2個(gè)基因的180條siRNA序列分析，歸納出以下8個(gè)與siRNA性相關(guān)的特征:G/C含量低（30%-52%），正義鏈3’端具較低穩(wěn)定性（有利于siRNA與RISC的結(jié)合和解鏈），無(wú)反向重復(fù)序列（有利于減小siRNA的有效作用濃度，提高siRNA干擾效率），正義鏈堿基的偏愛(ài)性A19（正義鏈中第19位堿基為A，如下表示類(lèi)同）；A3；U10；無(wú)G/C（正義鏈中第19位堿基不為G或C）；無(wú)G13。依此規(guī)則，Reynolds等設(shè)計(jì)的30條siRNA中有29條是有效的。Kumiko等亦認(rèn)為siRNA反義鏈5’端為A/U（即有義鏈U/A）19和zui后7個(gè)堿基中有5個(gè)A/U，會(huì)有助于RNAi的發(fā)揮，且正義鏈G/C1和序列中無(wú)連續(xù)9nt以上的GC重復(fù)片段與基因沉默效率呈顯著相關(guān)。有趣的是，該實(shí)驗(yàn)還表明這些規(guī)則同樣適用于DNA介導(dǎo)的RNAi（DNA-based RNAi.）實(shí)驗(yàn)。此外，Amarzguioui等發(fā)現(xiàn)正義鏈5’與3’端的前3個(gè)堿基中A/U含量不對(duì)稱(chēng)（3’端含量應(yīng)高一些）和A6對(duì)siRNA 的活性亦影響很大。根據(jù)上述結(jié)果，可以初步繪制出一個(gè)siRNA序列結(jié)構(gòu)的精細(xì)與簡(jiǎn)略示意圖。

現(xiàn)已知道siRNA的反義鏈決定著靶位點(diǎn)識(shí)別，那么在不影響siRNA作用功效的前提下，是否可以對(duì)其正義鏈堿基作適當(dāng)更改或修飾呢？Amarzguioui等研究siRNA不同部位對(duì)堿基突變和化學(xué)修飾的耐受性，認(rèn)為siRNA的5’端相對(duì)于3’端具有對(duì)突變的較高耐受性。有學(xué)者認(rèn)為正義鏈3’突出端的任何堿基修飾對(duì)siRNA作用效果均無(wú)明顯影響。還有學(xué)者認(rèn)為與反義鏈互補(bǔ)的正義鏈3’端發(fā)生1—4個(gè)堿基的錯(cuò)配反而有助于增強(qiáng)RNAI的活性。
二、siRNA制備方法
目前為止較為常用的5種制備siRNAs的方法包括
化學(xué)合成
體外轉(zhuǎn)錄
長(zhǎng)片斷dsRNAs經(jīng)RNase III 類(lèi)降解 （e.g. Dicer, E. coli, RNase III）
siRNA表達(dá)載體或者病毒載體在細(xì)胞中表達(dá)siRNAs
PCR制備的siRNA表達(dá)框在細(xì)胞中表達(dá)
前面3種方法包括體外制備siRNAs然后經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染或者電轉(zhuǎn)導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞后面兩種方法則依賴(lài)能夠表達(dá)siRNAs的DNA載體或者表達(dá)框轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。每種方法都有自己的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。哪種是的方法，其實(shí)取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。這里簡(jiǎn)單介紹這5種方法，優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，以及它們的應(yīng)用。
siRNA的設(shè)計(jì)
除了方法3以外，其他的方法都在制備siRNA 前都需要單獨(dú)設(shè)計(jì)siRNA序列。關(guān)于怎樣設(shè)計(jì)siRNA以及siRNA設(shè)計(jì)對(duì)siRNA功能的影響，盡管我們不斷掌握越來(lái)越多有關(guān)設(shè)計(jì)原則的信息。但這仍然不是的。通常來(lái)說(shuō)，每個(gè)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)3—4對(duì)siRNAs，在后面的實(shí)驗(yàn)中選擇zui有?的那個(gè)。網(wǎng)上有提供免費(fèi)的siRNA設(shè)計(jì)工具。
體外制備
1.化學(xué)合成
盡管化學(xué)合