Elisa試劑盒競爭法測抗原的原理與步驟
2021-04-21
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Elisa試劑盒競爭法測抗原的原理與步驟
當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去,或不易得到足夠的純化抗原時(shí),可用此法檢測特異性抗體。其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競爭與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗體量越多,結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少,因此陽性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)。如抗原為高純度的,可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質(zhì),直接包被不易成功,可采用捕獲包被法,即先包被與固相抗原相應(yīng)的抗體,然后加入抗原,形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質(zhì),然后再加標(biāo)本和酶標(biāo)抗體進(jìn)行競爭結(jié)合反應(yīng)。競爭法測抗體有多種模式,可將標(biāo)本和酶標(biāo)抗體與固相抗原競爭結(jié)合,抗HBc ELISA一般采用此法。另一種模式為將標(biāo)本與抗原一起加入到固相抗體中進(jìn)行競爭結(jié)合,洗滌后再加入酶標(biāo)抗體,與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)??笻Be的檢測一般采用此法。
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 以稀釋液將待檢標(biāo)本做適當(dāng)稀釋(預(yù)試中確定)加入包被有已知抗原的酶標(biāo)板中(50ul/孔),加封口膠帶于37℃作用30min。
2. 棄反應(yīng)液,以沖洗液連續(xù)洗板5次并于吸水紙上拍干。
3. 加入酶標(biāo)抗體(濃度在預(yù)試中確定)。加封口膠帶后于37℃作用30min。
4. 重復(fù)第2步。
5. 加底物(濃度在預(yù)試中確定),加封口膠帶后于室溫下避光作用5-60 min,其間不時(shí)觀察,顯色滿意后加終止液50ul/孔。
6. 于酶標(biāo)儀測定OD值,OPD用492nm測定,TMB用450nm測定。
注意事項(xiàng)
1. 每次實(shí)驗(yàn)均應(yīng)做陰性對照、陽性對照及空白對照(以PBS代替標(biāo)本),后者為本底值,在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)應(yīng)扣除本底值,陽性對照<陰性對照<空白對照實(shí)驗(yàn)成立。
2. 一般認(rèn)為小分子抗原宜用本法檢測,而大分子抗原則宜采用夾心法檢測,但具體宜采用哪種方法應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)決定,本發(fā)與夾心法相比在操作上減少一步。包被抗體與酶標(biāo)抗體如果分別采用單克隆抗體和多克隆抗體時(shí),宜用單克隆抗體作為包被抗體,以多克隆抗體作為酶標(biāo)抗體。
3. 血清標(biāo)本中抗原濃度一般較低,故一般用原倍標(biāo)本進(jìn)行檢測,必要時(shí)可進(jìn)行稀釋測定,但應(yīng)重新摸索酶標(biāo)抗原的濃度,以確保方法的靈敏性。
4. 以酶標(biāo)記抗原的方法同酶標(biāo)記抗體。
5. 其它注意事項(xiàng)同酶聯(lián)免疫間接法。