操作ELISA時需要留意這幾點
1. 正式試驗時,ELISA試劑盒應(yīng)分別以陽性對照與陰性對照操控試驗條件,待檢樣品應(yīng)作一式二份,以確保試驗結(jié)果的性。有時本底較高,闡明有非特異性反響,可采用羊血清、兔血清或BSA等關(guān)閉。
2. 在ELISA中,進行各項試驗條件的挑選是很重要的,其間包括:
① 固相載體的挑選:許多物質(zhì)可作為固相載體,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可所以凹孔平板、試管、珠粒等?,F(xiàn)在常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不論何種載體,在運用前均可進行篩選:用等量抗原包被,在同一試驗條件下進行反響,觀察其顯色反響是否均一性,據(jù)此判明其吸附功能是否杰出。
② 包被抗體(或抗原)的挑選:將抗體(或抗原)吸附在固相載體外表時,要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0~9.6之間。吸附溫度,時刻及其蛋白量也有必定影響,一般多采用4℃18~24小時。蛋白質(zhì)包被的zui適濃度需進行滴定:即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0和10μg/ml等)進行包被后,在其它試驗條件相一起,觀察陽性標本的OD值。ELISA試劑盒挑選OD值zui大而蛋白量zui少的濃度。關(guān)于多數(shù)蛋白質(zhì)來說一般為1~10μg/ml。
③ 酶標記抗體作業(yè)濃度的挑選:首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定(見酶標記抗體部份)。然后再固定其它條件或采取“方陣法”(包被物、待檢樣品的參閱品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度)在正式試驗體系里地滴定其作業(yè)濃度。
④ 酶的底物及供氫體的挑選:對供氫體的挑選要求是價廉、安全、有明顯地顯色反響,而自身無色。有些供氫體有潛在的致癌效果,ELISA試劑盒應(yīng)留意防護。有條件者應(yīng)運用不致癌、靈敏度高的供氫體,如TMB和ABTS是現(xiàn)在較為滿意的供氫體。底物效果一段時刻后,應(yīng)加入強酸或強堿以停止反響。一般底物效果時刻,以10-30分鐘為宜。底物運用液有必要新鮮配制,尤其是H2O2在臨用前加入。
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