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特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基

2011-04-12 [1568]

培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞,很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長(zhǎng)??傊?,MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)好的開始,各種目的無血清培養(yǎng)AIM V(12005)培養(yǎng)基(SFM)。
L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎?它在溶液中不穩(wěn)定嗎?
L-
谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后,L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時(shí)間后會(huì)降解,但是確切的降解率一直沒有zui終定論。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成,而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。
GlutaMAX-I是什么?培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I?這個(gè)二肽有多穩(wěn)定?
GlutaMAX-I
二肽是一個(gè)L-谷氨酰胺的衍生物,其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽,釋放L-谷氨酰胺供利用。
GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定,即使在121磅滅菌20分鐘,GlutaMAX-I 二肽溶液有zui小的降解,如果在相同條件下,L-谷氨酰胺幾乎*降解。
什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅?
酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為PH值的指示劑:中性時(shí)為紅色,酸性時(shí)為,堿性時(shí)為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用,(特別是雌激素)。為避免固醇類反應(yīng),培養(yǎng)細(xì)胞,尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí),用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測(cè),一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí),不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。
酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為PH值的指示劑:中性時(shí)為紅色,酸性時(shí)為,堿性時(shí)為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用,(特別是雌激素)。為避免固醇類反應(yīng),培養(yǎng)細(xì)胞,尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí),用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測(cè),一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí),不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。
如何用臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞?
用無血清培養(yǎng)基把細(xì)胞懸液稀釋到200~2000個(gè)/毫升,在0.1毫升的細(xì)胞懸液中加入0.1毫升的0.4%的臺(tái)盼蘭溶液。輕輕混勻,數(shù)分鐘后,用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞。活細(xì)胞排斥臺(tái)盼蘭,因而染成藍(lán)色的細(xì)胞是死細(xì)胞。
如何消除組織培養(yǎng)的污染?
當(dāng)重要的培養(yǎng)污染時(shí),研究者可能試圖消除或控制污染。首先,確定污染物是細(xì)菌、真菌、支原體或酵母,把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開,用實(shí)驗(yàn)室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺(tái),檢查HEPA過濾器。
高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對(duì)一些細(xì)胞系有毒性,因而,做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時(shí)尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟。
1.
在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞,稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。
2.
分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中,或幾個(gè)小培養(yǎng)瓶中。在一個(gè)濃度梯度范圍內(nèi),把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中。例如,兩性霉素B推薦下列濃度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。
3.
每天觀測(cè)細(xì)胞毒性指標(biāo),如脫落,出現(xiàn)空泡,匯合度下降和變圓。
4.
確定抗生素毒性水平后,使用低于毒性濃度2~3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2~3代。
5.
在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。
6.
重復(fù)步驟4。
7.
在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4~6代,確定污染是否以已被消除。
培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么?
丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源,盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,但是,如果沒有葡萄糖的話,細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。
Hank's 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用,不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么?Hank's 平衡鹽溶液(HBS)和Earle's平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別?
HBS
和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡,以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中,溶液會(huì)變堿,Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會(huì)變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織,需要用Eagles液,。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的組織,用Hanks液就可以了。
二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎?使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的是什么?
二價(jià)離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前,用EDTA清洗細(xì)胞,以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子。
我試用SF900 II時(shí),細(xì)胞生長(zhǎng)良好,但是我的蛋白產(chǎn)物不如使用Graces 液和10%胎牛血清時(shí)效果好。
如果目的蛋白是一個(gè)后期蛋白,它將與蛋白酶一起表達(dá),這些蛋白酶將會(huì)作用于目的蛋白。在加有血清的培養(yǎng)基中,這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白,從而使目的蛋白產(chǎn)品保持完好。在無血清配方中,蛋白酶作用的*底物是你的目的蛋白。為了避免這一問題,加入一些蛋白酶抑制劑或加入少量的血清(少于1%),讓血清給蛋白酶提供作用底物。
20°C下配制的緩沖液,在較高或較低的溫度下PH值會(huì)改變嗎?
對(duì)于普通使用的緩沖液,PH值隨溫度變化而變化。
下表列出溫度改變10℃時(shí),PH值的變化情況:
例如 20下配制PH7.4 Tris緩沖液,40時(shí)PH值為 7.4-(2x0.310)=6.78
緩沖系統(tǒng) pKa/20 [ Delta]pKa/10
Mes 6.15 -0.110
Ada 6.60 -0.110
Pipes 6.80 -0.085
Aces 6.90 -0.200
Bes 7.15 -0.160
Mops 7.20 -0.013
Tes 7.50 -0.200
Hepes 7.55 -0.140
Tricine 8.15 -0.210
Tris 8.30 -0.310
Bicine 8.35 -0.180
Glycylglycine 8.40 -0.280
室溫下(25?)配制的Tris-HCl溶液,在37℃使用時(shí)PH值是多少?
緩沖液的PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃,25℃,37℃時(shí),不同的PH值。
4°C
25°C
37°C
8.1
7.5
7.2
8.2
7.6
7.3
8.3
7.7
7.4
8.4
7.8
7.5
8.5
7.9
7.6
8.6
8.0
7.7
8.7
8.1
7.8
8.8
8.2
7.9
8.9
8.3
8.0
9.0
8.4
8.1
9.1
8.5
8.2
9.2
8.6
8.3
9.3
8.7
8.4
9.4
8.8
8.5
室溫下(25?)配制的Tris-HCl溶液,在37℃使用時(shí)PH值是多少?
緩沖液的PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃,25℃,37℃時(shí),不同的PH值。
昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)的zui適PH值和滲透壓是多少?
生長(zhǎng)培養(yǎng)基的PH值對(duì)細(xì)胞的增殖和病毒或重組蛋白的生產(chǎn)均會(huì)產(chǎn)生影響。對(duì)于大部分鱗翅類昆蟲細(xì)胞系,在PH值 6.0~6.4范圍的大部分應(yīng)用效果良好。培養(yǎng)鱗翅類昆蟲細(xì)胞系時(shí),培養(yǎng)基的zui適滲透壓是345-380mOsm/kg.。為保證可靠和持久的細(xì)胞培養(yǎng)方式,減少技術(shù)問題,保持PH值和滲透壓在以上所列的范圍之內(nèi)。
胰酶消化一個(gè)T25瓶的sf9細(xì)胞:
 
1.
去除培養(yǎng)基。
2.
用2ml 1xPBS(足以覆蓋細(xì)胞表面)洗滌細(xì)胞,去除PBS。
3.
加入2ml 1x胰酶EDTA(恰好覆蓋細(xì)胞表面)。
4.
37 孵育5到10分鐘。在儀器下檢測(cè)看到5分鐘后它們正在向上移動(dòng)。
5.
向細(xì)胞中加入2ml 細(xì)胞培養(yǎng)液,移入錐形管,用2ml培養(yǎng)液洗瓶壁,移入同一錐形管中。(培養(yǎng)基中的FBS終止了胰酶的活性。)
6.
離心(1100rpm)沉淀細(xì)胞。去除培養(yǎng)基。